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最新觀點 | Nature Communications:北京大學現代農業研究院/河北農業大學解析小麥廣譜抗葉銹病基因Lr47

作者:弓晏婉、董振營

小麥葉銹病是禾本科植物普遍發生的一種氣傳性真菌病害,嚴重威脅全球小麥的安全生產,可造成小麥產量損失約5%-20%??寺『屠每谷~銹病基因,培育抗病小麥品種是防治該病害最經濟、安全、有效的方法。Lr47 來自小麥近緣物種擬斯卑爾脫山羊草,編碼一個典型的CC-NBS-LRR蛋白,對目前全球主要葉銹菌流行小種具有全生育期廣譜抗性。

2023年9月,北京大學現代農業研究院陳時盛研究員團隊與河北農業大學王逍冬教授合作在 Nature Communications 上發表了題為“ Cloning of the wheat leaf rust resistance gene Lr47 introgressed from Aegilops speltoides ”的研究論文。本研究在精細定位的基礎上,利用改進的MutRNASeq方法,克隆了廣譜抗葉銹病基因 Lr47 。進一步利用EMS誘變、BSMV-sgRNA介導的基因編輯、轉基因互補驗證等方法對該基因進行了功能驗證。并且為了消除連鎖累贅,創制了新的短片段易位系,促進了該基因的育種利用。此外,轉錄調控、亞細胞定位、蛋白互作等方面,初步探索該基因的抗病機制。

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研究人員首先將 Lr47 基因從擬斯卑爾脫山羊草7S染色體片段通過遠緣雜交易位至六倍體小麥7A染色短臂,研究表明 Lr47 對分離獲得的24個葉銹菌流行小種都表現出高水平抗性。通過多態性分析,確定易位系Kern-Lr47含有約150 Mb的外源7S染色體片段。研究人員進一步引入中國春 ph1b 突變體誘導部分同源染色體配對重組,獲得了Kern Lr47 × ZZ5389群體2654株F3代植株,同時利用EMS感病突變體和野生型構建分離群體得到的1141個F2代植株,最終將 Lr47 精細定位到3.5 Mb的染色體區間內,候選區間內包含49個具有注釋基因,其中6個為典型NLR基因(圖1)。

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圖1. 抗葉銹病基因 Lr47 的抗性表型及其精細定位

隨后利用改進的MutRNASeq方法鑒定 Lr47 候選基因。研究人員首先從野生型Kern-Lr47 和10個獨立的感病EMS突變體進行轉錄組測序,利用參考基因組TS01和CS候選區間內的同源NLR基因序列,對Kern Lr47 轉錄組數據庫進行BLASTN搜索,鑒定出45類候選轉錄本;將10個感病EMS突變體的RNA-Seq數據與45個Kern-Lr47轉錄序列進行對比,發現一個名為KN638873_g379_i12的轉錄本具有G/C到A/T的突變。進一步PCR驗證和基因結構分析,表明KN638873_g379_i12包含一個NLR基因(命名為CNL2),EMS突變體中的點突變導致轉錄提前終止(圖2)。


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圖2. 利用EMS突變體獲得 Lr47 候選基因

由于基于BSMV-sgRNA的基因編輯系統需要預先表達Cas9的品系,利用Kern-Lr47與轉入Cas9元件的小麥Bobwhite進行雜交,對F1植株進行BSMV-sgRNA介導的基因編輯。經系列比對驗證,對 CNL2 基因ATG下游2280位敲除了堿基“T”或“TT”的純合缺失造成 Lr47 的移碼突變的2個株系(mut-1和mut-2)進行進一步分析。表型鑒定證實mut-1和mut-2較Kern-Lr47更易感病。進一步將Kern-Lr47 攜帶 CNL2 的7234 bp基因組DNA片段轉化到春小麥品種Fielder中,共獲得80個獨立的轉基因T0代植株,對T1轉基因家系接種了7個不同葉銹菌小種,轉基因陽性植株對葉銹菌都表現出抗性,而陰性對照Fielder完全敏感(圖3),進一步證明抗病候選基因即為CNL2。


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圖3. BSMV-sgRNA誘導的基因編輯和轉基因互補驗證

由于Kern-Lr47 攜帶較大染色體片段,CNL2 與一些不利基因相連鎖。為進一步對 CNL2 育種應用。利用 ph1b 突變體誘導部分同源染色體7S和7A配對,通過兩輪的篩選,分別獲得了36 Mb和13 Mb新型短片段易位系(圖4)。通過進一步回交,將其轉育到我國感銹病小麥品種“揚麥21”(YM21),抗病表型鑒定表明獲得的短片段易位系(YM21 + Lr47-1)抗性顯著提高。在無病害狀態下對BC3F3姊妹系進行15個農藝性狀評估,發現除了穗長外,其余農藝性狀均沒有顯著性差異(圖5)。 

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圖4.Lr47 短片段易位系創制、表型及細胞學鑒定

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圖5. YM21 + Lr47-1 產量和品質性狀評估

通過qRT-PCR檢測 Lr47 接菌前后的相對表達量,結果顯示無明顯差異,表明 Lr47  基因的表達水平不受病原菌誘導。煙草葉片和小麥原生質體亞細胞定位結果表明,Lr47蛋白定位于植物細胞質和細胞核中。在煙草葉片中瞬時表達Lr47全長蛋白及包括CC結構域在內的不同肽段,均未觀察到明顯細胞壞死反應或葉片黃變現象(圖6)。

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圖6. Lr47蛋白抗病分子機制

綜上,該研究成功克隆了小麥全生育期廣譜抗葉銹病基因 Lr47,豐富了葉銹病抗性的基因資源庫。進一步創制了短片段滲入系材料,消除或減少了有害連鎖,開發了可用輔助育種的分子標記,為 Lr47 基因在現代小麥育種中的應用提供了有用的工具。



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https://doi.org/10.1038/s41467-023-41833-2








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