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最新觀點 | 維生素B6生物合成最新進展

作者:李依萍、李煥改

維生素 B是一種生物體必需的營養元素,包含吡哆醇(PN)、吡哆胺(PM)、吡哆醛(PL)及其磷酸化衍生物5'-磷酸吡哆醇(PNP)、5'-磷酸吡哆胺(PMP)和5'-磷酸吡哆醛(PLP)六種形式。植物和微生物具有維生素 B的天然新生物合成途徑,但人類和動物必須從外部獲取,因此維生素 B在制藥、食品行業和牲畜飼料中具有很高的商業價值。PLP是維生素 B中最活躍的形式,它在氨基酸和糖代謝、血紅素合成以及神經遞質合成等生化過程中是重要的輔酶;而維生素 B中的PN是最常見的商業形式,但目前只能完全依賴化學合成。

近日,中國科學院天津工業生物技術研究所張大偉研究組在國際權威期刊 Nature Communications 發表了題為“Protein engineering and iterative multimodule optimization for vitamin B6 production in Escherichia coli ”的研究論文。該研究以大腸桿菌為底盤細胞,重構維生素 B從頭合成途徑,采用并行通路工程、蛋白工程和迭代多模塊優化方式實現高水平 PN 生產。

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PNP是維生素 B生物合成的直接產物,它通常作為代謝途徑酶的輔因子,具有較活躍的催化活性,但是高濃度的PNP對細胞具有毒性。因此,本研究采用生長解耦策略,即在不抑制產物形成的情況下快速積累生物量。運用平行代謝通路方式,利用一種途徑生產目標商業化學品PN,而另一種途徑則合成細胞生長和維持所必需的PLP(圖1); 通過敲除PNP氧化酶來分離兩條途徑,阻止PNP轉化為PLP,從而使兩條途徑在同一菌株中代謝正交,而不會相互干擾,既不影響細胞生長又可生產高水平的目標產物PN。

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圖1. 利用平行代謝途徑工程重構維生素B6生物合成途徑

生物合成酶的效率直接決定了代謝反應的速率,進而控制通量分布,并最終影響產品的產量。為了增加PN生產的拉力,使產量最大化,該研究采用蛋白理性設計和自然篩選等方法對合成途徑起始酶Epd和Dxs以及限速酶PdxA和PdxJ進行異源篩選和理性設計改造,從而提高限速酶的性能(圖2)。

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圖2. 限速酶PdxA和PdxJ的合理設計

PdxB 是參與催化維生素B6生物合成的第二步的煙堿酶, 而SerC為其下游PLP依賴性氨基轉移酶。為了進一步提高維生素 B的產量,研究者利用PdxB和SerC代謝工程來增加中間代謝途徑的通量(圖3)。此外,當SerC過表達時,不僅增加PN 生物合成的代謝通量,同時通過空間接近有助于PdxB的多次周轉。

4.png圖3. PdxB和SerC代謝工程

最后,研究者采用模塊化代謝工程策略,通過將合成通路模塊化來重建宿主的代謝平衡,從而實現工程通路表達水平的整體微調。在這項研究中,整個維生素B6通路被劃分為上游推力模塊和下游拉力模塊(圖4)。這些模塊在4HTP處分離,4HTP是一種有毒中間體。上游模塊由Epd、Dxs、PdxB和SerC組成,通過提供足夠的DXP和中間4HTP來增強推動力;下游路徑由PdxA和PdxJ組成,以增加拉力,實現有效組裝和優化。最終在5升生物反應器中對維生素B6高產菌株LL388進行了飼料批量發酵,與之前報告的大腸桿菌菌株相比PN產量增加了18倍。

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圖4. 維生素B6生物合成途徑的迭代多模塊優化

綜上所述,在這項工作中,研究者首先利用維生素B6生物合成途徑的平行代謝途徑工程,解耦細胞生長所需的PLP和目的產物PN的生物合成;進而通過序列和結構引導的蛋白質工程,改善維生素B6生物合成途徑的關鍵酶,包括起始酶Epd/Dxs和限速酶PdxA/PdxJ;之后進行迭代多模塊優化,結合代謝途徑基因,并平衡上下模塊的表達,以最大限度地提高PN產量;最終的工程大腸桿菌菌株在5升的生物反應器中,通過批量喂食發酵可產生1.4克/升的PN,從而實現PN的從頭合成以及高效生產。該研究的迭代多模塊優化策略對改善其他有價值的化學品的生產具有良好的參考價值,也為維生素B6的綠色生物生產及其未來的工業化奠定了堅實的基礎。


原文鏈接

https://www.nature.com/articles/s41467-023-40928-0







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