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最新觀點| Nature Communications:利用性狀關聯突變體測序技術快速克隆小麥抗條銹病基因YrNAM

作者:秦申、李煥改

小麥條銹病是由小麥條銹菌(Pst )引起的真菌性病害,嚴重影響小麥生產,抗條銹病基因的克隆是小麥抗條銹病品種高效育種的關鍵。目前,在已報道的86個小麥抗黃銹病基因座中,僅有7個基因被克隆,且大部分是通過圖位克隆而獲得。圖位克隆法需要構建遺傳和物理圖譜,繁瑣、費力且耗時。與圖位克隆法不同的是,基于DNA和/或RNA測序的方法不需要構建遺傳圖譜,而是通過使用獨立的突變體克隆候選基因。這些方法主要針對特定的染色體或基因類別,從而避免其他基因組的干擾。最近,一些抗銹基因已經通過使用測序為基礎的方法被克隆出來。例如,通過MutRenSeq法克隆了Yr7,Yr5/YrSP,Sr22,Sr26,Sr45Sr61;使用MutChromSeq法克隆了Sr43 ;通過MutRNASeq法克隆了Sr62 。

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近日,山東農業大學農學院吳佳潔教授團隊在Nature Communications上發表了題為“Sequencing trait-associated mutations to clone wheat rust-resistance gene YrNAM ”的研究論文。該研究開發了利用性狀關聯突變體測序(Sequencing trait-associated mutations,STAM)方法克隆了小麥條銹病抗性基因YrNAM。

在這項研究中,首先使用Pst 抗性品系P10-46(WT)和7個Pst 敏感的M3系突變體進行STAM(圖1a和b)。經過STAM,在7個易感突變體中共檢測到7434個突變位點(G→A和C→T),其中有一個轉錄本(T59230)在除M62外的6個易感突變體中發生突變(表1)。進一步研究發現,突變體M62的后代出現了抗感表型分離,且感病后代在T59230轉錄本中同樣存在一個G→A的突變。此外,T59230在其他五個未進行STAM的易感突變體中發生突變??傊?,T59230在所有12個易感突變體中均有突變(圖1c)。因此,T59230是抗條銹病的候選基因。


表1. STAM測序數據統計

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圖1. STAM技術鑒定小麥抗條銹病基因YrNAM


對P10-46進行了基因組重測序,結果發現Contig NODE_33935與T59230完全匹配。通過序列比對,T59230由五個外顯子組成,CDS全長為1227 bp,編碼蛋白YrNAM的N端和C端分別具有NAM和ZnF-BED結構域(圖1c)。突變體分析表明,NAM和ZnF-BED結構域都是抗性所必需的;12個感病EMS突變體中的6個在NAM結構域中發生突變,另外6個在ZnF-BED結構域中發生突變(圖1c)。

為了進一步驗證YrNAM是P10-46的抗性基因,研究者使用P10-46和一個Pst 易感突變體M19創建了F2群體。結果發現113株F2幼苗的條銹病抗性和敏感性分離為3:1;且YrNAM 連鎖分子標記與條銹病敏感性完全相關。

為驗證YrNAM對Pst 的抗性,構建YrNAM過表達載體(圖2a),并將其轉化到小麥條銹病敏感品系Fielder和CB037。結果表明轉基因植物的感病表型與YrNAM的表達密切相關:表達YrNAM的轉基因植株對Pst表現出免疫或者高抗表型,而未表達YrNAM的植株則表現出感病表型(圖2b,c)。因此,轉基因YrNAM賦予植株小麥條銹病抗性。


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圖2. 遺傳互補實驗表明YrNAM具有條銹病抗性


在中國春基因組1B中發現兩個YrNAM 的同源基因,而在1A和1D中無同源基因。系統發育分析和分子標記調查揭示了長山羊草(Aegilops longissima)和沙融羊草(Ae. sharonensis)中具有YrNAM 同源基因,表明YrNAM 是一個古老的基因,起源早于小麥B亞基因組和D亞基因組祖先的形成,大約發生在730萬年前。系統發生樹分析顯示YrNAM的ZnF-BED結構域高度保守,而與禾本科NLR-BED基因的ZnF-BED結構域明顯不同,僅有37-44%的相似性。因此,YrNAM中ZnF-BED結構域的插入與NLR Rph15和Yr5/Yr7中ZnF-BED結構域的插入無關。

為了研究YrNAM在栽培小麥中的分布,從659份小麥材料中篩選了60份含Yr10AF149112)抗性的小麥品系。僅有四個品系對分子標記YrNAM-F8R7 (位于YrNAM 的3’末端)呈陽性,但對其他分子標記YrNAM-F1R3(位于YrNAM 的5’末端)和YrNAM-F02R2(位于YrNAM 基因內部)呈陰性。然后在另一組小麥種質種進行了檢測,包括578個中國品種和高級育種系以及59個匈牙利品種,并未在其中任何一個品種發現YrNAM 。上述結果表明大多數小麥品系中不存在YrNAM 基因,作者推測這可能與一種不受歡迎的性狀Rg1 相關。

綜上所述,利用STAM技術快速克隆了小麥抗條銹病基因YrNAM ,并對其抗性進行了遺傳解析。該研究實現了小麥條銹病抗性基因的快速克隆,為抗條銹病小麥品種的培育提供了重要的基因資源,同時對其他優良性狀基因的克隆具有重要的借鑒意義。




原文鏈接:

https://doi.org/10.1038/s41467-023-39993-2



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